شناسائی گونه‏های تریکودرما با استفاده از توالی‏یابی جزئی ژن‏های nrRNA و tef1α همراه با معرفی Trichoderma capillare برای میکوفلور ایران

پژوهش های حفاظت گیاهان ایران

مقاله 1، دوره 31، شماره 3 - شماره پیاپی 37، مهر 1396، صفحه 362-373   

نوع مقاله: مقالات پژوهشی

شناسه دیجیتال (DOI): 10.22067/jpp.v31i3.48738

نویسندگان

مهدی مهرابی کوشکی^* ؛ مریم باورساد؛ رضا فرخی نژاد

دانشگاه شهید چمران اهواز

چکیده

گونه‏های تریکودرما به فراوانی در خاک‏های کشاورزی یافت می‏شوند و اغلب آن‏ها بعنوان عامل بیوکنترلی علیه بیمارگرهای گیاهی عمل می‏کنند. آن‏ها همچنین بعنوان تولید‏کننده‏های صنعتی آنزیم‏ها شناخته می‏شوند. با توجه به اهمیت این قارچ، شناسائی صحیح آن‏ها در سطح گونه ضروری می‏باشد. شناسائی گونه‏ها مبتنی بر خصوصیات ریخت‏شناسی با توجه به هموپلاسی زیاد در صفات ظاهری مناسب نمی‏باشد. در این تحقیق، 40 جدایه‏ تریکودرما از استان‏های اصفهان، اراک و همدان با استفاده از توالی‏یابی جزئی ژن‏های nrRNA و tef1α شناسائی شد. جدایه‏ها در محیط PDB کشت شد و توده میسیلیومی با استفاده از کاغذ صافی جمع‏آوری شد. میسیلیوم‏ها در لیوفیلیزر خشک-‏انجمادی و سپس از آن استخراج DNA شد. واکنش زنجیره‏ای پلی‏مراز جهت تکثیر حدود 550 و 900 جفت باز بترتیب از نواحی ITS و tef1α با استفاده از آغازگر‏های عمومی و تخصصی انجام شد. قطعات تکثیری توالی‏یابی شد و بعد از ویراستاری و جستجو با استفاده از الگوریتم BLASTn، در بانک ژن ذخیره گردید. بر اساس صفات ریخت‏شناسی و آنالیز توالی‏های نوکلئوتیدی ITS و tef1α، جدایه‏ها در هفت گروه گونه‏ای شامل Trichoderma harzianum، T. capillare ، T. pleuroticola، T. asperellum، T. koningiopsis، T. brevicompactum و T. virens توزیع شدند. درخت فیلوژنتیکی این جدایه‏ها با استرین‏های مرجع تیپ بر اساس توالی tef1α ترسیم شد که در آن خوشه‏بندی فیلوژنتیکی تولید شده اصالت گونه‏ای جدایه‏های مورد بررسی را تأیید کرد. این اولین گزارش گونه T. capillare برای میکوفلور ایران است.

کلیدواژه‌ها

DNA-بارکدینگ؛ خوشه ‏بندی فیلوژنتیک؛ ریخت‏ شناسی

مراجع

1- Ainsworth G.C. 1971. Ainsworth and Bisby’s dictionary of the fungi. 6th ed. Common wealth Mycological Institute, Kew, Surrey, England.

2- Crouse J., and Amorese D. 1987. Ethanol precipitation: ammonium acetate as an alternative to sodium acetate. Focus, 9: 3–5.

3- Dodd S., Crowhurst R.N., Rodrigo A.G., Samuels G.J., Hill R.A., and Stewart A. 2003. Examination of Trichoderma phylogenies derived from ribosomal DNA sequence data. Mycological Research, 4: 32-39.

4- Druzhinina I., and Kubicek C.P. 2005. Species concepts and biodiversity in Trichoderma and Hypocrea: from aggregate species to species clusters. Journal of Zhejiang University Science Botany, 6: 100-112.

5- Druzhinina I.S., Kopchinskiy A.G., Komon M., Bissett J., Szakacs G., and Kubicek C.P. 2005. An oligonucleotide barcode for species identification in Trichoderma and Hypocrea. Fungal Genetics and Biology, 42: 813-828.

6- Druzhinina I.S., Kopchinskiy A.G., and Kubicek C.P. 2006. The first one hundred of Trichoderma species is characterized by molecular data. Mycoscience, 47: 55-64.

7- Druzhinina I.S., Komo -Zelazowska M., Ismaiel A., Jaklitsch W., Mullaw T., Samuels G.J., and Kubicek C.P. 2012. Molecular phylogeny and species delimitation in the section Longibrachiatum of Trichoderma. Fungal Genetics and Biology, 49: 358-368.

8- Gams W., and Bissett J. 1998. Morphology and identification of Trichoderma. pp. 3-31. In C.P. Kubicek and G.E. Harman (eds.) Trichoderma and Gliocladium, Taylor & Francis, London.

9- Geiser D.M., Jimenz Gasco M.M., Kang S., Mkalowska I., Veeraraghavan N., Ward T.J., Zhang N., Kuldau G.A., and O’Donnell K. 2004. Fusarium-IDv.1.0: A DNA sequence database for identifying Fusarium. European Journal of Plant Pathology, 110: 473-479.

10- Hall T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series, 41: 95-98.

11- Harman G.E., Howell C.R., Viterbo A., Chet I., and Lorito M. 2004. Trichoderma species-opportunistic, avirulent plant symbionts. Nature Review Microbiology, 2:43–56.

12- Hebert P.D.N., Cywinska A., Ball S.L., and deWaard J.R. 2003a. Biological identifications through DNA barcodes. Proceedings of the Royal Society of London: Series B, 270: 313–321.

13- Hebert P.D.N., Ratnasingham S., and deWaard J.R. 2003b. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proceedings of the Royal Society of London: Series B, 270: 96–99.

14- Karimi S. 2005. Help to identification of Trichoderma species and endomycorrhizae as useful fungi of walnut rhizosphere in Hamadan province. MSc thesis, agriculture faculty, Buali Sina University of Hamadan, Iran. (In Persian with English abstract)

15- Kopchinskiy A.G., Komon M., Kubicek C.P., and Druzhinina I.S. 2005. TrichoBLAST: A multilocus database for Trichoderma and Hypocrea identifications. Mycological Research, 109:657–660.

16- Kullnig-Gradinger C., Szakacs G., and Kubicek C.P. 2002. Phylogeny and evolution of the genus Trichoderma: a multigene approach. Mycological Research, 106:757–767.

17- Mehrabi-Koushki M., Rouhani H., and Farsi M. 2011. Genetic manipulation of fungal strains for Improvement of heterologous genes expression (a minireview). African Journal of Biotechnology, 10: 7939-7948.

18- Mehrabi-Koushki M., Rouhani H., and Mahdikhani-Moghaddam E. 2012. Differential display of abundantly expressed genes of T. harzianum during colonization of tomato-germinating seeds and roots. Current Microbiology, 65:524–533.

19- Naeimi S., Khodaparast S.A., Javan-Nikkhah M., Vagvolgyi. C., and Kredics L. 2011. Species patterns and phylogenetic relationships of Trichoderma strains in rice fields of southern Caspian sea, Iran. Cereal Research Communications, 39: 560–568.

20- Nazmi-Roodsari F., Zafari D., Khodaparast A., and Rouhani H. 2007. Introducing some new species of Trichoderma for Iran. Rostaniha, 8:67-88.

21- Raeder U., and Broda P. 1985. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Letters in Applied Microbiology, 1: 17–20.

22- Samuels G.J., Ismaiel A., Mullaw T.B., Szakacs G., Druzhinina I.S., Kubicek C.P., and Jaklitsch W.M. 2012. The Longibrachiatum Clade of Trichoderma: a revision with new species. Fungal Diversity, 55:77-108.

23- Samuels G.J., Chaverri P., Farr D.F., and McCray E.B. 2016. Trichoderma Online, Systematic Mycology and Microbiology Laboratory, ARS, USDA, available from: http://nt.ars-grin.gov/taxadescriptions/keys/TrichodermaIndex.cfm.

24- Shoukouhi E., and Bissett J. 2008. Preferred primers for sequencing the 50 end of the translation elongation factor 1-alpha gene (EF1-a1) and subunit 2 of the RNA polymerase B gene (RPB2). ISTH available from: http://www.isth.info/methods.

25- Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., and Kumar S. 2013. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution, 30: 2725-2729.

26- Vahabi K. 2004. Genetic diversity of Trichoderma species related to Agaricus bisporus mushroom using morphological and molecular methods. MSc. Thesis, agriculture faculty, Isfahan University of the technology, Iran. (In Persian with English abstract)

27- White T.J., Bruns T., Lee S., and Taylor J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. P315–322. In: MA Innis et al. (ed.) PCR Protocols: a guide to methods and applications. Academic Press, New York, USA.

28- Zafari D., Zare R., Ershad D., and Alizadeh A. 2003. A contribution to the identification of Trichderma species in Iran. Iranian Journal of Plant Pathology, 38: 9-15. (In Persian with English abstract)

29- Zafari D., Zare R., Ershad D., and Alizadeh A. 2004. Introduction of three new species of Trichoderma for mycoflora of Iran. Rostaniha, 5: 63-65. (In Persian with English abstract)