بهینه‌سازی روش‌های مولکولی شناسایی نماتد عامل ریشه‌گره‌ای (Meloidogyne javanica)

پژوهش های حفاظت گیاهان ایران

مقاله 3، دوره 34، شماره 3 - شماره پیاپی 49، مرداد 1399، صفحه 309-324   

نوع مقاله: مقالات پژوهشی

شناسه دیجیتال (DOI): 10.22067/jpp.v34i3.84588

نویسندگان

رحمان کشاورز کوهجردی^{* 1}؛ علی پاک نیت جهرمی²؛ مهرزاد هنرور³؛ مجید پاک نیت جهرمی²

¹رشته مهندسی کشاورزی علوم باغبانی، بیوتکنولوژی و ژنتیک مولکولی محصولات باغبانی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد استهبان

²بخش تحقیقات گیاه‌پزشکی، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی فارس، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، زرقان، ایران

³دانشگاه آزاد اسلامی واحد استهبان، گروه بیوتکنولوژی و ژنتیک مولکولی محصولات باغبانی، استهبان، ایران

چکیده

به منظور شناسایی سریع مراحل مختلف رشدی گونه Meloidogyne javanica که در ایران به عنوان یکی از خسارتزاترین نماتدهای گیاهی شناخته شده، تعداد 40 نمونه خاک و ریشه آلوده به نماتد ریشه‌گره‌ای از نقاط مختلف جالیزکاری استان فارس (داراب، جنت شهر، استهبان، نورآباد، کوار و شیراز) جمع‌آوری گردید. پس از خالص‌سازی به روش تک کیسه تخم روی ریشه گوجه فرنگی رقم Rutgers و شناسایی گونه M. javanica بر اساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی (مورفولوژی) و ریخت‌سنجی ماده‌های بالغ و لارو سن دوم، DNA ژنومی کلیه مراحل رشدی از مرحله تخم، لارو سن دوم و ماده‌های بالغ نماتد، به سه روش ژانگ، سیلوا و لیوآ استخراج شد. DNA استخراج شده با کمک جفت آغازگرهای اختصاصی گونه Fjav/Rjav, Mj-MF/Mj-MR, Mj-DF/Mj-DR  تکثیر گردید. در کلیه مراحل رشدی گونه M. javanica یک قطعه 1650 جفت بازی توسط جفت آغازگر Mj-DF/Mj-DR ، یک قطعه 517 جفت بازی توسط جفت آغازگر Mj-MF/Mj-MR و یک قطعه 670 جفت بازی توسط جفت آغازگر Fjav/Rjav تکثیر شد ولی این قطعات با جفت آغازگر MI-F و MI-R، مربوط به نماتد M. incognita و آب که به عنوان کنترل منفی در آزمایش استفاده شده بودند تکثیر نشدند. لذا به نظر می‌رسد کاربرد این جفت آغازگرها در قیاس با خصوصیات ریخت‌شناسی در مراحل مختلف رشدی نماتد به تشخیص سریع تر گونه M. javanica منجر می‌شود. در بهینه‌سازی PCR برای تشخیص نماتد M. javanica بهترین دما برای آغازگرهای Mj-MF و Mj-MR، 56 درجه سانتی‌گراد برای Mj-DF و Mj-DR، 50 درجه سانتی‌گراد و برای Fjav و Rjav، 54 درجه سانتی‌گراد تعیین گردید، میزان DNA الگو حاصل از روش‌های مختلف استخراج در آزمون PCR در خصوص ماده کامل و کیسه تخم از یک میکرولیتر به دو میکرولیتر و لارو سن دوم از دو میکرو لیتر به چهار میکرولیتر بهترین نتیجه حاصل شد. در خصوص MgCl2 با افزایش میزان آن از 5/1 میلی‌مولار به 2 میلی‌مولار در واکنش 25 میکرولیتری PCR بهترین نتیجه حاصل گردید. بهترین روش استخراج که قادر به ردیابی تک لارو سن دوم نماتد بود روش لیوآ در نظر گرفته شد. بهترین آغازگرها که قادر به ردیابی نماتد  M. javanicaدر تمام مراحل رشدی بودند، جفت آغازگرMj-MF/Mj-MR و Fjav/Rjav بودند.

کلیدواژه‌ها

آغازگر اختصاصی؛ بهینه سازی PCR؛ نماتد ریشه گرهی؛ M. javanica

مراجع

1-       Adam M.A.M., Phillips M.A., and Blok V.C. 2005. Identification of Meloidogyne spp. from North East Libya and comparison of their inter and intra-specific genetic variation using RAPDs. Nematology 7(4): 599-609.

2-       Askarian H., Sharif Nabi A., Mehdikhani Moghaddam E., and Akhavan A. 2009. Identification of Meloidogyne javanica species using morphological and morphometric properties and species specific primers in Kerman province. Journal of Science and Technology of Agriculture and Natural Resources 10(47): 279-289.

3-       Decraemer W., and Hunt D.J. 2006. Structure and Classification. In: Plant nematology. Perry, N. R, and Moens, M. (ed.). CABI International. pp. 4-32.

4-       Dong K., Dean R.A., Fortnum B.A., and Lewis S.A. 2001. Development of PCR primer to identify species of root knot nematodes: Meloidogyne arenaria, M. hapla, M.incognitaand M. javanica. Nematropica31: 273-282.

5-       Esbenshade P.R., and Triantaphyllow A.C. 1985. Use of enzyme phenotypes for the identification of Meloidogyne species. Journal of Nematology17: 6-20.

6-       Fadavi Khalajloo Gh., Mehdikhani Moghaddam E., and Rouhani H. 2014. Intra-species genetic diversity of different populations of Meloidogyne javanica in tomato fields of North Khorasan province using RAPD-PCR marker. Journal of Plant Protection 6(1): 55-70.

7-       Fargetette M., Lollier V., Philips M., Blok V., and Frutos R. 2005. AFLP analysis of the genetic diversity of Meloidogyne chitwoodi and M. fallax, major agriculturalpests. Genetics 328: 455-462.

8-       Gasser R.B. 2001. Identification of parasitic nematodes and study of genetic variabilitusing PCR approaches. Parasitic Nematodes Molecular Biology, Biochemistry and Immunology. CAB international, pp 53-82.

9-       Holterman M., van der Wurff A., van den Elsen S., van Megen H., Bongers T., Holovachov O., and Helder J. 2006. Phylum-wide analysis of SSU rDNA reveals deep phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades. Molecular Biology and Evolution 23(9): 1792-1800.

10-   Liao J., Yang W., Feng Z., and Karssen G. 2005. Description of Meloidogyne panyuensis sp. n. (Nematoda: Meloidogynidae), parasitic on peanut. Russian Journal of Nematology 13(2): 107-114.

11-   Mehdikhani Moghaddam E., Kheiri A., and Mohammadi M. 2006. Protein motifs of different populations of two species, M. javanica and M. incognita in Iran by the SDS-PAGE method. 17^th Iranian Congress of Plant Protection, p. 489. (In Persian with English abstract)

12-   Mehdikhani Moghaddam E., Kheiri A., and Mohammadi M. 2006. Molecular comparison of populations of Meloidogyne javanica and Meloidogyne incognita in Iran by PCR-RFLP method. Journal of Water and Soil Science 10(4): 405-410.

13-   Meng Q.P., Long H., and Xu J.H. 2004. PCR assays for rapid and sensitive identification of three major root-knot nematodes, Meloidogyne incognita, M. javanica and M. arenaria. Acta Phytopathologica Sinica 34(3): 204-210.

14-   Moens M., Perry R.N., and Starr J.L. 2009. Meloidogyne species–a diverse group of novel and important plant parasites. Root-knot nematodes, p 483.

15-   Mokaram Hesar A., Mehdikhani Moghaddam E., and Tanha Maafi Z. 2010. Morphological and genetic variation among different populations of M. javanica on different hosts in fields of Khorasan Razavi province. 19^th Iranian Plant Protection Congress, p. 603.

16-   Shokouhi A., Mirzaei M., and Amini M. 2012. Molecular investigation of root knot nematode, M. javanica, from Kerman using ribosomal DNA ITS sequencing. 20^th Iranian Congress of Plant Protection, p 654. (In Persian with English abstract)

17-   Silva A.T., Peena J.C., Goulart L.R., Santos M.A., and Arantes N.E. 2000. Genetic variability among and within races of Heterodera glycines Ichinohe assessed by RAPD markers. Genetics and Molecular Biology 23(2): 323-329.

18-   Zhang Y.P, Uymoto J.K., and Kirkpatrick B.C. 1998. A small-scale procedure for extracting nucleic acids from woody plants infected with various phytoplasmas for PCR assay. Journal of Virological Methods 71: 45-50.

19-   Zijlstra C. 2000. Identificatin of Meloidogyne chitwoodi, M. fallax and M. hapla based on SCAR-PCR: a powerful way of enabling reliable identification of populations or individuals that share common traits. European Journal of Plant Pathology 106: 238-290.

20-   Zijlstra C., Donkers-Venne D.T.H.M., and Fargette M. 2000. Identification of Meloidogyne incognita, M. javanica and M. arenaria using sequence characterize amplified region (SCAR) based PCR assays. Nematology2: 847-853.