استفاده از روش PCR رقابتی و Real-time PCR مطلق به منظور کمی سنجی جمعیت باکتری تولید کننده بوتیرات: بوتیریویبریو فیبری سالونس

پژوهشهای علوم دامی ایران

مقاله 7، دوره 7، شماره 4 - شماره پیاپی 24، دی 1394، صفحه 486-491   

نوع مقاله: علمی پژوهشی- ژنتیک و اصلاح دام و طیور

شناسه دیجیتال (DOI): 10.22067/ijasr.v7i4.36543

نویسندگان

مجتبی طهمورث پور^{* 1}؛ امیر طاهری²؛ محمدهادی سخاوتی²

¹گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.

²گروه علوم دامی، دانشکده کشـاورزی، دانشـگاه فردوسـی مشهد، مشهد، ایران

چکیده

سویه های باکتری بوتیریویبریو فیبری سالونس به عنوان عمده ترین گروه باکتری های تولید کننده بوتیرات در دستگاه گوارش بسیاری از حیوانات و همچنین انسان شناخته شده اند. در این مطالعه دو تکنیک مبتنی بر DNA شامل PCR رقابتی و Real-time PCR به منظور شمارش باکتری های گونه بوتیریویبریو فیبری سالونس استفاده شدند. در ابتدا آغازگرهای اختصاصی برای منطقه 16S rDNA باکتری بوتیریویبریو فیبری سالونس به منظور تکثیر یک قطعه 213 جفت بازی استفاده شدند. یک قطعه رقابتگر با تفاوت طول 50 جفت باز بیشتر ساخته شد و در ناقل پلاسمیدی pTZ57R/T همسانه سازی شد. کمیت رقابتگر پلاسمیدی با استفاده از نانودراپ اسپکتروفتومتری سنجیده شد و به صورت سریالی رقیق سازی شد. رقت های حاصل به همراه DNA استخراج شده از مایع شکمبه بطور همزمان تکثیر شدند. به منظور کمی سازی محصولات PCR پس از عکس برداری از ژل آگارز و استفاده از نرم افزار ImageJ ، مقادیر تکثیر شده از DNA هدف در مقابل مقادیر تکثیر شده از رقابتگر به صورت لگاریتمی ترسیم شدند. از ضریب تبیین (R2) به عنوان معیاری جهت ارزیابی دقت تکنیک استفاده گردید. برای توسعه Real-time PCR، قطعه 213 جفت بازی تکثیر شده و همسانه‌سازی شده در ناقل پلاسمیدی pTZ57R/T به منظور رسم منحنی استاندارد استفاده شد. نتایج نشان دادند که هر دو روش قابلیت استفاده برای شمارش باکتری های جنس بوتیریویبریو فیبری سالونس را دارا هستند و بنابراین می توانند به عنوان ابزارهای مناسب در تحقیقات مرتبط با این باکتری مورد استفاده قرار بگیرند.

کلیدواژه‌ها

بوتیریویبریو فیبری سالونس؛ کمی سنجی اسیدهای نوکلئیک؛ QCPCR؛ Real-Time PCR

مراجع

1- Asanuma, N., M. Kawato., and T. Hino. 2001. Presence of Butyrivibrio fibrisolvens in the digestive tract of dogs and cats, and its contribution to butyrate production. The Journal of general and applied microbiology, 47(6): 313-319.

2- Balamurugan, R., S. P. Chittaranjan., A. M. Chandragunasekaran., and B. S. Ramakrishna. 2009. Molecular detection of the ruminal bacterium, Butyrivibrio fibrisolvens, in feces from rural residents of southern India. Microbial ecology in health and disease, 21(1): 38-43.

3- Boeckaert, C., B. Vlaeminck., V. Fievez., L. Maignien., J. Dijkstra., and N. Boon. 2008. Accumulation of trans C18:1 fatty acids in the rumen after dietary algal supplementation is associated with changes in the Butyrivibrio community. Applied and environmental microbiology, 74(22): 6923-6930.

4- Celi, F. S., M. E. Zenilman., and A. R. Shuldiner. 1993. A rapid and versatile method to synthesize internal standards for competitive PCR. Nucleic Acids Research, 21(4): 1047.

5- Cheng, K. J., and J. W. Costerton. 1977. Ultrastructure of Butyrivibrio fibrisolvens: a gram-positive bacterium. Journal of Bacteriology, 129(3): 1506-1512.

6- Deutsch, S., U. Choudhury., G. Merla., C. Howald., A. Sylvan., and S. E. Antonarakis. 2004. Detection of aneuploidies by paralogous sequence quantification. Journal of Medical Genetics, 41(12): 908-915.

7- Dhanasekaran, S., T. M. Doherty., and J. Kenneth. 2010. Comparison of different standards for real-time PCR-based absolute quantification. Journal of immunological methods, 354(1): 34-39.

8- Diviacco, S., P. Norio., L. Zentilin., S. Menzo., M. Clementi., G. Biamonti., S. Riva., A. Falaschi., and M. Giacca. 1992. A novel procedure for quantitative polymerase chain reaction by coamplification of competitive templates. Gene, 122(2): 313-320.

9- Forster, R. J., J. Gong., and R. M. Teather. 1997. Group-specific 16S rRNA hybridization probes for determinative and community structure studies of Butyrivibrio fibrisolvens in the rumen. Applied and environmental microbiology, 63(4): 1256-1260.

10- Fukuda, S., Y. Suzuki., M. Murai., N. Asanuma., and T. Hino. 2006. Isolation of a novel strain of Butyrivibrio fibrisolvens that isomerizes linoleic acid to conjugated linoleic acid without hydrogenation, and its utilization as a probiotic for animals. Journal of Applied Microbiology, 100(4): 787-794.

11- Gilliland, G., S. Perrin., K. Blanchard., and H. F. Bunn. 1990. Analysis of cytokine mRNA and DNA: detection and quantitation by competitive polymerase chain reaction. Proceedings of the National Academy of Sciences, 87(7):2725-2729.

12- Godornes, C., B. T. Leader., B. J. Molini., A. Centurion-Lara., and S. A. Lukehart. 2007. Quantitation of rabbit cytokine mRNA by real-time RT-PCR. Cytokine, 38(1): 1-7.

13- Kato, K., R. Yamashita., R. Matoba., M. Monden., S. Noguchi., T. Takagi., and K. Nakai. 2005. Cancer gene expression database (CGED): a database for gene expression profiling with accompanying clinical information of human cancer tissues. Nucleic Acids Research, 33(Database issue): D533-536.

14- Kim, M., and Z. Yu. 2012. Quantitative comparisons of select cultured and uncultured microbial populations in the rumen of cattle fed different diets. Journal of Animal Science and Biotechnology, 3(1): 28.

15- Kobayashi, Y., R. J. Forster., and R. M. Teather. 2000. Development of a competitive polymerase chain reaction assay for the ruminal bacterium Butyrivibrio fibrisolvens OB156 and its use for tracking an OB156-derived recombinant. FEMS Microbiology Letters, 188(2): 185-190.

16- Koike, S., J. Pan., Y. Kobayashi., and K. Tanaka. 2003. Kinetics of in sacco fiber-attachment of representative ruminal cellulolytic bacteria monitored by competitive PCR. Journal of Dairy Science, 86(4): 1429-1435.

17- Lee, C., J. Kim., S. G. Shin., and S. Hwang. 2006. Absolute and relative QPCR quantification of plasmid copy number in Escherichia coli. Journal of Biotechnology, 123(3): 273-280.

18- Lusic, M., A. Marcello., A. Cereseto., and M. Giacca. 2003. Regulation of HIV-1 gene expression by histone acetylation and factor recruitment at the LTR promoter. EMBO Journal, 22(24): 6550-6561.

19- Mrazek, J., and J. Kopecny. 2001. Development of competitive PCR for detection of Butyrivibrio fibrisolvens in the rumen. Folia Microbiologica, (Praha). 46(1): 63-65.

20- Ohkawara, S., H. Furuya., K. Nagashima., N. Asanuma., and T. Hino. 2005. Oral administration of butyrivibrio fibrisolvens, a butyrate-producing bacterium, decreases the formation of aberrant crypt foci in the colon and rectum of mice. Journal of Nutrition, 135(12): 2878-2883.

21- Rychlik, J. L., and J. B. Russell. 2002. Bacteriocin-like activity of Butyrivibrio fibrisolvens JL5 and its effect on other ruminal bacteria and ammonia production. Applied and Environmental Microbiology, 68(3): 1040-1046.

22- Sekhavati, M. H., M. D. Mesgaran., M. R. Nassiri., T. Mohammadabadi., F. Rezaii., and A. Fani Maleki. 2009. Development and use of quantitative competitive PCR assays for relative quantifying rumen anaerobic fungal populations in both in vitro and in vivo systems. Mycological Research, 113(Pt 10): 1146-1153.

23- Yu, Y., C. Lee., J. Kim., and S. Hwang. 2005. Group-specific primer and probe sets to detect methanogenic communities using quantitative real-time polymerase chain reaction. Biotechnology and Bioengineering, 89(6): 670-679.

24- Zentilin, L. and M. Giacca. 2007. Competitive PCR for precise nucleic acid quantification. Nature Protocols, 2(9): 2092-2104.

25- Zimmermann, K. and J. W. Mannhalter. 1996. Technical aspects of quantitative competitive PCR. BioTechniques, 21(2): 268-279.