توسعه روش مؤثر باززایی و ترانسفورماسیون توتون از طریق بهینه سازی غلظت تنظیم کننده های رشد و ساکارز

علوم باغبانی

مقاله 1، دوره 31، شماره 4، اسفند 1396، صفحه 803-814   

نوع مقاله: مقالات پژوهشی

شناسه دیجیتال (DOI): 10.22067/jhorts4.v31i4.62194

نویسندگان

ماریا بیهقی^{* 1}؛ عبدالرضا باقری¹؛ سید حسن مرعشی¹؛ مجتبی سنکیان²؛ افسانه فرساد³

¹دانشگاه فردوسی مشهد

²دانشگاه علوم پزشکی مشهد

³دانشگاه بیرجند

چکیده

گیاه توتون یک بیوراکتور بسیار کارا به منظور تولید پروتئین‌های نوترکیب می‌باشد، لذا در این پروژه تحقیقاتی علاوه بر بهینه‌سازی سیستم کشت بافت این گیاه، فرآیند مناسب انتقال ژن به آن نیز مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور اثرات غلظت‌های مختلف ساکارز و 4 ترکیب متفاوت هورمونی (BAP و NAA) روی القا کالوس، شاخه‌زایی مستقیم و ریشه‌زایی در قالب طرح کامل تصادفی به صورت فاکتوریل و با سه تکرار مورد آزمایش قرار گرفت. حساسیت ریزنمونه‌های توتون به آنتی‌بیوتیک کانامایسین با کشت ریزنمونه‌ها روی محیط انتخابی دارای غلظت‌های مختلف کانامایسین ارزیابی شد. برای انتقال ژن از اگروباکتریوم (Agrobacterium tumefacien) سویه GV3101 حاوی پلاسمید pBI121 استفاده شد و روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) جهت بررسی گیاهان تراریخته مورد استفاده قرار گرفت. نتایج تجزیه واریانس و مقایسه میانگین نشان داد که بالاترین میزان القا کالوس با استفاده از محیط کشت M1 (حاوی 1/0 میلی‌گرم در لیتر NAA و 1 میلی‌گرم در لیتر BAP) با غلظت 15 گرم در لیتر ساکارز حاصل شد. در صورتی‌که تعداد بالای شاخه‌زایی مستقیم در محیط کشت M1 با غلظت 30 گرم در لیتر ساکارز بدست آمد. بیشترین فراوانی ریشه‌زایی نیز توسط 1/0 میلی‌گرم در لیتر NAA و 60 گرم در لیتر ساکارز حاصل شد. غلظت 50 میلی‌گرم در لیتر کانامایسین بطور کامل از باززایی نمونه‌های غیرتراریخته ممانعت کرد و بنابراین از این غلظت در محیط کشت انتخابگر استفاده شد. در نهایت، قطعهbp 798 مربوط به ژن nptII در ژنوم گیاهان تراریخته توتون تأیید شد و کارایی تراریختگی با استفاده از روش اگروباکتریوم بیش از 95 درصد محاسبه گردید. تکنیک باززایی مستقیم و انتقال ژن مطرح شده در این تحقیق جهت وارد کردن ژن‌های خارجی مختلف به ژنوم گیاه توتون بسیار کارا و مؤثر می‌باشد.

کلیدواژه‌ها

تراریختگی؛ توتون؛ ژن انتخابگر nptII؛ شاخه‌زایی مستقیم؛ کشت بافت

مراجع

1- Ali G., Hadi F., Ali Z., Tariq M., and Khan M.A. 2007. Callus Induction and in vitro Complete Plant Regeneration of Different Cultivars of Tobacco (Nicotiana tabacum L.) on Media of Different Hormonal Concentrations. Biotechnology, 6: 561-566.

2- Babbar S.B., Jain R., and Walia N. 2005. Guar gum as a gelling agent for plant tissue culture media. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant, 41(3):258–261.

3- Ekrum G. 2001. Insertion of an antimicrobial gene into Agrobacterium and its further use in transforming tobacco. Turkish Journal of Botany, 25:169-175.

4- Gangopadhyay G., Das S., Mitra S.K., Poddar R., Modak B.K., and Mukherjee K. 2002. Enhanced rate of multiplication and rooting through the use of coir in aseptic liquid culture media. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 68: 301–310.

5- Habibi-Pirkoohi M., Malekzadeh-Shafaroudi S., Marashi H., Moshtaghi N., Nassiri M.R., and Zibaee S. 2014. Transient Expression of Foot and Mouth Disease Virus (FMDV) Coat Protein in Tobacco (Nicotiana tabacom) via Agroinfiltration. Iranian Journal of Biotechnology, 12: 28-35.

6- Joshi N. 2009. In Vitro Growth and Shoot Multiplication in Nicotiana tabacum L-influence of gelling agent and carbon source. International Journal of Plant Developmental Biology, Global Science Books.

7- Klems M., Balla J., Machackova I., Eder J., and Prochazka S. 2000. The uptake and metabolism of 3H-benzylaminopurine in tobacco (Nicotiana tabacum L.) and cucumber (Cucumis sativus L.) explants. Plant Growth Regulation, 31(3):135–142.

8- Leuba V., and LeTourneau D. 1990. Auxin activity of phenylacetic acid in tissue culture. Journal of Plant Growth Regulation, 9:71-76.

9- Linsmaier E.M., and Skoog F. 1965. Organic Growth Factor Requirements of Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum, 18:100-127.

10- Lucyszyn N., Quoirin M., Homma M.M., and Sierakowski M.R. 2007. Agar/galactomannan gels applied to shoot regeneration from tobacco leaves. Biologia Plantarum, 51(1):173–176.

11- Mangat B.S., and JANJUA S. 1987. Cyclic Nucleotides and In Vitro Plant Cultures: Induction of organogenesis in tobacco (Nicothiana tabacum) callus cultures. Journal of Experimental Botany, 38 (12):2059-2067.

12- Miao-Miao Y., Chan X., Chun-Hwan K., Yeong-Cheol U., Amadou Apho B., and De-Ping G. 2009. Effects of explant type, culture media and growth regulators on callus inductionand plant regeneration of Chinese jiaotou (Allium chinense). Scientia Horticulturae, 123:124-128.

13- Mohan Pathi K., Tula S., and Tuteja N. 2013. High frequency regeneration via direct somatic embryogenesis and efficient Agrobacterium- mediated genetic transformation of tobacco. Plant Signaling & Behavior, 8:6.

14- Murashige T., and Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant Physiology Journal. 15: 473–497.

15- Nhut D.T., Aswath C.R., Teixeira da Silva J.A., Le B.V., Thorpe T., and Tran Thanh Van K. 2003. Tobacco Thin Cell Layer Morphogenesis. Thin Cell Layer Culture System: Regeneration and Transformation Applications, 17-63.

16- Nugroho H., and Verpoorte R. 2002. Secondary metabolism in tobacco. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 68:105-125.

17- Ozel C.A., Khawar K.M., and Arslan O. 2008. A comparison of the gelling of isubgol, agar and gelrite on in vitro shoot regeneration and rooting of variety Samsun of tobacco (Nicotiana tabacum L.). Scientia Horticulturae, 117(2):174–181.

18- Parc G., Rembur J., Rech P., and Chriqui D. 2007. In vitro culture of tobacco callus on medium containing peptone and phytate leads to growth improvement and higher genetic stability. Plant Cell Reports, 26(2):145-52.

19- Ramage C.M., and Williams R.R. 2002. Inorganic nitrogen requirements during shoot organogenesis in tobacco leaf discs. Journal of Experimental Botany, 53(373):1437-43.

20- SAS. 2001. SAS/STAT User’s Guide (8.02) SAS Institute Inc., Cary, NC, USA.

21- Smykalova I., Smirous P., Kubosiova M., Gasmanova N., and Griga M. 2009. Doubled haploid production via anther culture in annual, winter type of caraway (Carum carvi L.). Acta Physiologiae Plantarum, 31:21-31.

22- Stolarz A., Macewicz J., and Lorz H. 1991. Direct somatic embryogenesis and plant regeneration from leaf explants of Nicotiana tabacum L. Journal of Plant Physiology, 137:347-357.

23- Taravat E., Sohrabi M., and Zebarjadi A. 2012. Optimization and gene transformation of Tobacco. Proceedings of 7th national biotechnology congress of I.R. Iran. (in Persian with English abstract).

24- Teixeira da Silva J.A. 2002. Polyamines in the regulation of chrysanthemum and tobacco in vitro morphogenic pathways. Propagation of Ornamental Plants, 2: 9-15.

25- Teixeira da Silva J.A. 2005. Simple multiplication and effective genetic transformation (four methods) of in vitro-grown tobacco by stem thin cell layers. Plant Science, 169: 1046–1058.

26- Teixeira da Silva J.A., and Fukai S. 2001. The impact of carbenicillin, cefotaxime and vancomycinon chrysanthemum and tobacco TCL morphogenesisand Agrobacterium growth. Journal of Applied Horticulture, 3(1):3-12.

27- Tran Thanh Van M., Dien N.T., and Chlyah A. 1974. Regulation of organogenesis in small explants of superficial tissue of Nicotiana tabacum L. Planta, 119(2):149-59.

28- Van den Ende G., Croes A.F., Kemp A., and Barendse G.W.M. 1984a. Development of flower buds in thin-layer cultures of stalk tissue from tobacco: Role of hormones in different stages. Physiologia Plantarum, 61: 114–118.

29- Van den Ende G., Croes A.F., Kemp A., Barendse G.W.M., and Kroh M. 1984b. Floral morphogenesis in thin-layer tissue cultures of Nicotiana tabacum. Physiologia Plantarum, 62: 83–88.

30- Yanjie C. 2007. Callus induction and plant regeneration From leaf explants of tobacco. Available at http://nhjy.hzau.edu.cn/kech/xbgc/sy/PDF/ChaoYanjie.pdf.

31- Zhan-sheng P., Ji-yao C., and Huai-xin C. 1989. The regulation effect of the light and hormones on morphogenesis in tobacco leaf tissue cultures. Acta biologiae experimentalis Sinica, 22 (3):279-285.