ارزیابی آزمون LAMP با خصوصیت رنگ‌سنجی جهت ردیابی چشمی Ralstonia solanacearum در محموله‌های سیب‌زمینی ایستگاههای قرنطینه‌ای ایران

پژوهش های حفاظت گیاهان ایران

مقاله 7، دوره 31، شماره 2 - شماره پیاپی 36، شهریور 1396، صفحه 277-283   

نوع مقاله: مقالات پژوهشی

شناسه دیجیتال (DOI): 10.22067/jpp.v0i0.57217

نویسندگان

امه هانی نبوی چاشمی¹؛ ساره بقائی راوری^{* 1}؛ ماهرخ فلاحتی رستگار¹؛ کبری مسلم خانی²؛ وحید جهانبخش³

¹گروه گیاهپزشکی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد

²استادیار موسسه تحقیقات ثبت و گواهی بذر و نهال، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، تهران. ایران

³دانشگاه فردوسی مشهد

چکیده

نژاد 3، بیووار 2 از کمپلکس گونه‏ای Ralstonia solanacearum خسارات اقتصادی قابلتوجهی را به سیبزمینی در سراسر دنیا وارد می‏سازد. بنابراین دستیابی به روش ردیابی حساس و اختصاصی بهمنظور حذف مواد گیاهی آلوده در مراکز تحقیقات و ایستگاههای بازرسی قرنطینه گیاهی ضروری می‏باشد. در مطالعه حاضر پس از جداسازی کلنی‏های شبیه R. solanacearum از غده‏های آلوده سیبزمینی در محیط تترازولیوم کلراید، تاییدمولکولی گونه با استفاده از آغازگرهای اختصاصی انجام گرفت. براساس آزمون استفاده از منابعکربنی و واکنشزنجیره‏ایپلیمراز اختصاصی نیز، جدایه‏های بدستآمده متعلق به بیووار 2 و فیلوتایپ II می‏باشند. آزمون بیماریزایی بر روی گیاهچه‏های سیبزمینی و گوجهفرنگی برای جدایه‏ها انجام و بیماریزایی جدایهها بررسی گردید. ارزیابی غده‏های آلوده و یا مشکوک به آلودگی با اعمال PCR سنتی و واکنش LAMP بر روی ژن fliC بااستفاده از DNA‏ی استخراجشده و عصاره آلوده سیبزمینی انجامگرفت. الگوی نردبانی محصولات LAMP و ردیابی چشمی رسوب پیروفسفات و یا تغییررنگ ایجادشده در نمونه‏های آلوده به واسط کاربرد کالسئین، دلالتبر ردیابی موفق R. solanacearum توسط واکنش LAMP دارد. اگرچه حساسیت آزمون LAMP (CFU/ml 104) مساوی و یا کمتر از PCR سنتی است، اما دقت واکنش مزبور جهت تایید قابل اطمینان وجود R. solanacearum در غده‏های سیبزمینی کافی می‏باشد. درمجموع، آزمون LAMP به همراه مرحله آشکارسازی کارایی چون استفاده از کالسئین، اطلاعات اولیه مناسبی را جهت غربالگری غده‏های آلوده قبل از انبارداری و در حین حملونقل استانی مهیا می‏سازد.

کلیدواژه‌ها

آلودگی پنهان؛ پوسیدگی قهوه‏ای؛ ردیابی چشمی؛ fliC، LAMP

مراجع

Boudazin G., Le Roux A.C., Josi K., Labarre P., and Jouan B. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology. 105:373–380.

2-Chen W.P., and Kuo T.T. 1993. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Research. 21: 2260.

3-Fegan M., and Prior P. 2005. How complex is the Ralstonia solanacearum species complex? In: Allen C, Prior P, Hayward AC, eds. Bacterial Wilt: The Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. St. Paul, MN, U.S.A.: American Phytopathological Society Press, 449-461.

4-Fu S., Qu G,, Guo S,, Ma L,, Zhang N. 2011. Applications of loop-mediated isothermal DNA amplification. Applied Biochemistry and Biotechnology, 163: 845–850.

5-Hayward A.C., 1991. Biology and epidemiology of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum. Annual Review of Phytopathology. 29: 65–87.

6-Hayward A.C. 1994. Systematics and phylogeny of Pseudomonas solanacearum and related bacteria. In: Hayward AC, Hartman GL, eds. Bacterial Wilt: the Disease and its Causative Agent, Pseudomonas solanacearum. Wallingford, UK: CAB International, 123–35.

7-Kaneko H., Kawana T., Fukushima E., and Suzutani T. 2007. Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances. Journal of Biochemistry and Biophysical Methods, 70: 499-501.

8-Kubota R., Vine B.G., Alvarez A.M., and Jenkins D.M. 2008. Detection of Ralstonia solanacearum by loop-mediated isothermal amplification. Phytopathology, 98:1045–1051.

9-Lenaric R,, Morisset D,, Pirc M,, Llop P,, Ravnikar M., and Dreo T. 2014. Loop-mediated isothermal amplification of specific endoglucanase gene sequence for detection of the bacterial wilt pathogen Ralstonia solanacearum. PLoS ONE, 9: e96027

10-Machado J., Grimont F., and Grimont P.A.D. 2000. Identification of Escherichia coli flagellar types by restriction of the amplified fliC gene. Research Microbiology, 151: 535–546.

11-Moradi A., Nasiri J., Abdollahi H., Almasi A. 2012. Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Erwinia amylovora base on chromosomal DNA. European Journal of plant pathology, 133: 609. Doi: 10.1007/s10658-012-9939-y

12-Morgan J.A.W., Bellingham N.F., Winstanley C., Ousley M.A., Hart C.A., and Saunders J.R., 1999. Comparison of flagellin genes from clinical and environmental Pseudomonas aeruginosa isolates. Applied and Environmental Microbiology, 65:1175–1179.

13-Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., Watanabe K., Amino N., and Hase T. 2000. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research, 28: E63.

14-Nouri S., Bahar M., and Fegan M. 2008. Diversity of Ralstonia solanacearum causing potato wilt in Iran and the first record of phylotype ΙΙ/biovar 2T strain outside South America. Plant Pathology, 58: 243– 249.

15-Opina N., Tavner F., Holloway G., Wang J.F., Li T.H., Maghirang R., Fegan, M., Hayward A.C., Krishnapillai V., Hong W.F., Holloway B.W., and Timmis J.N. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology. 5:19-30.

16-Pastrik K.H., and Maiss E. 2000. Detection of Ralstonia solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. Journal of Phytopathology, 148: 619–626.

17-Pastrik K.H., Elphinstone J.G., and Pukall R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology, 108:831-842.

18-Poussier S., Prior P., Luisetti J., Hayward C., and Fegan M. 2000. Partial sequencing of the hrpB and endoglucanase genes confirms and expands the known diversity within the Ralstonia solanacearum species complex. Systematic and Applied Microbiology, 23:479-486.

19-Schaad N.W., Jones J.B., and Chun W. 2001. Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic bacteria. 3rd ed. American Phytopathological Society St. Paul, MN, USA, 378 pp.

20-Schonfeld J., Gelsomino A., van Overbeek L.S., Gorissen A., Smalla K., and van Elsas J.D. 2003. Effects of compost addition and simulated solarisation on the fate of Ralstonia solanacearum biovar 2 and indigenous bacteria in soil. FEMS Microbiology and Ecology. 43:63–74.

21-Seal S.E., Jackson L.A., Young J.P., and Daniels M.J. 1993. Differentiation of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii, and the blood disease bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. Journal of General Microbiology, 139: 1587–1594.

22-Tasteyre A., Karjalainen T., Avesani V., Delmee M., Collignon A., Bour-lioux P., and Barc M.C. 2000. Phenotypic and genotypic diversity of the flagellin gene (fliC) among Clostridium difficile isolates from different sero-groups. Journal of Clinical Microbiology, 38: 3179-3186.

23- Tomita N., Mori Y., Kanda H., Notomi T. 2008. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP( of gene sequences and simple visual detection of products. Nature Protocols, 3, 877–882.

24-Ward L., Harper S., Clover G. 2010. Development of a LAMP assay for Xylella fastidiosa. MAF Biosecurity New Zealand Technical Paper No: 2010/14.

25-Wicker E., Grassart L., Coranson-Beaudu R., Mian D., Guilbaud C., Fegan M. 2007. Ralstonia solanacearum Strains from Martinique (French WestIndies) Exhibiting a New Pathogenic Potential. Applied and Environmental Microbiology. 71: 6790–6801.

26-Yasuhara-Bell J., Marrero G., De Silva A., Alvarz A.M. 2016. Specific detection of Pectobacterium carotovorum by loop-mediated isothermal amplification. Molecular Plant Pathology, DOI: 10.1111/mpp.12378.