تولید و بررسی ویژگیهای آنزیم نوترکیب ریبونوکلئاز پانکراس گوسفند

پژوهشهای علوم دامی ایران

مقاله 8، دوره 13، شماره 3 - شماره پیاپی 47، مهر 1400، صفحه 429-440   

نوع مقاله: علمی پژوهشی- ژنتیک و اصلاح دام و طیور

شناسه دیجیتال (DOI): 10.22067/ijasr.2020.38319.0

نویسندگان

مهسا ضابطیان¹؛ محمدرضا نصیری^{* 2}؛ علی جوادمنش¹؛ شاهرخ قوتی³

¹گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.

²گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران

³گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه گیلان، گیلان، ایران

چکیده

همان‌طور‌که تحقیقات گوناگون نشان داده‌اند، در سال‌های اخیر، میزان مرگ‌ومیر براثرِ سرطان رشد چشمگیری داشته است؛ به‌همین‌دلیل است که محققان درپیِ تولید داروهای جدید، به‌ویژه داروهایی با اثرات جانبی کمتر، هستند. برهمین‌اساس، آنزیم ریبونوکلئاز پانکراس گوسفند نیز یکی از بهترین اورتولوگ‌ها برای آنزیم ریبونوکلئاز پانکراس گاو است که آن را در القای مرگ سلول‌های سرطانی به‌کار می‌گیرند. آنزیم گوسفندی تنها در 4 اسیدآمینۀ A19S، K37Q، V46F و N103E با آنزیم گاوی تفاوت دارد. در مطالعۀ پیش‌رو، ابتدا شکل سه‌بعدی آنزیم ریبونوکلئاز پانکراس گوسفند پیش‌بینی و سپس از‌نظر پایداری بررسی شد. درادامه، مشخصات فیزیکوشیمیایی این آنزیم با برنامه پرات پارام نیز مورد بررسی قرار گرفت.  همچنین، با استفاده ازروش‌های بیوانفورماتیکی شبیه‌سازی و با‌توجه ‌به RMSF، RMSD و Gyration analyses میزان پایداری پروتئین نیز پیش‌بینی گردید. مطالعات آزمایشگاهی نیز از ‌قبیل بررسی فرار این آنزیم از RI، میزان مقاومت آن درمقابل پپسین، غلظت پروتئین تولیدی، قابلیت القای مرگ سلولی در سلول‌های سرطانی و نیز میزان فعالیت این آنزیم، انجام گرفت. نتایج این تحقیق نشان می‌دهد که آنزیم مدنظر پس از 22 ساعت انکوبه در مجاورت پپسین تا 90% دست‌نخورده باقی می‌مانَد. میزان غلظت پروتئین تولیدی نیز mg/ml 4.78 بود که با استفاده از روش برادفورد تخمین زده شد. در این مطالعه فعالیت آنزیم ریبونوکلئاز طبیعی پانکراس گوسفند 558±22 U/mol برآورد شد. همان‌طورکه در تحقیقات گذشته نشان داده شده است، انواعِ RNaseA گاو و گوسفند نمی‌توانند وارد سلول شوند و درنتیجه هیچ‌گونه سمیت سلولی نشان نمی‌دهند، ولی در این مطالعه با استفاده از لیپوفکتامین، این آنزیم‌ها وارد سلول شدند و مرگ سلولی را به سلول‌های سرطانی Hella القا کردند. میزان زنده‌مانی سلول‌ها نیز به‌روش MTT assay  اندازه‌گیری شد. براساس این تحقیق، مشخص شد که آنزیم ریبونوکلئاز پانکراس گوسفندی فعالیت آنزیمی و توکسیتی مشابهی با آنزیم ریبونوکلئاز پانکراس گاوی دارد و برای استفاده به‌عنوان توکسین در تولید ایمونوتوکسین‌ها جانشین مناسبی است.

کلیدواژه‌ها

آنزیم ریبونوکلئاز پانکراس گوسفند؛ بیوانفورماتیک؛ سمیت سلولی؛ فعالیت زیستی

مراجع

1. Ardelt, W., K. Shogen, and Z. Darzynkiewicz. 2008. Onconase and amphinase, the antitumor ribonucleases from Rana pipiens oocytes. Current Pharmaceutical Biotechnology, 9(3):215-225.
2. Barnard, E. 1969. Biological Function of Pancreatic Ribonuclease. Nature, 221: 340- 344.
3. Becker, R. R., J. L. Halbrook, and C. Hirs.. 1973. Isolation and Characterization of Ovine Ribonuclease A, B, and C from Pancreatic Secretion. Journal of Biological Chemistry, 248:7826-7832.
4. Breukelman, H. J., N. Munnik, and R. Kleineidam. 1998. Secretory ribonuclease genes and pseudogenes in true ruminants. Gene, 212(2):259-68.
5. J. J., and J. M. van der Laan. 1986. Comparison of the structure of turtle pancreatic ribonuclease with those of mammalian ribonuclease. The Federation of European Biochemical Societies, 194(2):338–343.
6. Claudi, M., M. Cuchillo, R. Victòria Nogués, and T. Raines. 2011. Bovine Pancreatic Ribonuclease: 50 Years of the First Enzymatic Reaction Mechanism. The Journal of Biochemistry, 50(37):7835–7841.
7. De Lorenzo, C., A. Nigro, R. Piccoli, and G. D'Alessio. 2002. A new RNase-based immunoconjugate selectively cytotoxic for ErbB2-overexpressing cells. The Federation of European Biochemical Societies, 516(1-3):208-212.
8. De Lorenzo, C., A. Arciello, R. Cozzolino, D. B. Palmer, P. Laccetti, R. Piccoli, and G. D'Alessio. 2004. A fully human antitumor immunoRNase selective for ErbB-2-positive carcinomas. Cancer Research, 64(14):4870-4874.
9. DelCardayr, S. B., M. Ribio, E. M. Yokel, D. J. Quirk, W. J. Rutter and R. T. Ruines. 1995. Engineering ribonuclease A: Production, purification and characterization of wild-type enzyme and mutants at Glnll. Protein Engineering, 18:261-273.
10. Forouharmehr, A., M. Nassiri, S. Ghovvati, and A. Javadmanesh. 2020. Production and introduction of a novel immunotoxin based on mutant RNase A for inducing death to Her1‐positive cell lines. Journal of Cell Physiology, doi: 10.1002/jcp.29346
11. Forouharmehr, A., M. Nassiri, S. Ghovvati, and A. Javadmanesh, A. 2018. Different Signal Peptides for Secretory Production of Recombinant Bovine Pancreatic Ribonuclease A in Gram Negative Bacterial System: An In silico Study. Current Proteomics, 15: 24-31
12. R. F., and J. Atkins. 1993. The RNA World. Cold SpringHarbor LaboratoryPress Plainview, NY.
13. Ghovvati, S. 2014. Engineering ScFv-FC antibody bound to RNase to target HER2 antigen. Doctoral dissertation, Ferdowsi University. (In Persian)
14. He, F. 2011. Bradford Protein Assay. Biotechnology Innovation Organization, 101:e45. 10.21769.45.
15. Jaydarian, A., N. Nazifi, and A. Forouharmehr. 2020. Computational design of a novel multi-epitope vaccine against Coxiella burnetii. Human Immunology, 10:10-16.
16. Leich, F., N. Stohr, A. Rietz, R. Ulbrich-Hofmann, and U. Arnold. 2007. Endocytotic internalization as a crucial factor for the cytotoxicity of ribonucleases. Journal of Biological Chemistry, 282(38):27640-27646.
17. Lomax, J. E., C. M. Bianchetti, A. Chang, G. N. Phillips, B. G. Fox, and R. T. Raines. 2014. Functional evolution of ribonuclease inhibitor: insights from birds and reptiles. Journal of Molecular Biology, 426(17):3041‐3056.
18. Lu, L., J. Li, M. Moussaoui, and E. Boix. 2018. Immune Modulation by Human Secreted RNases at the Extracellular Space. Frontiers in Immunology, 9:1012.
19. Menzel, C., T. Schirrmann, Z. Konthur, T. Jostock, and S. Dubel. 2008. Human antibody RNase fusion protein targeting CD30+ lymphomas. Blood, 111(7):3830-3837.
20. Merlino, A., L. Mazzarella, A. Carannante, A. Di Fiore, A. Di Donato, E. Notomista, and F. Sica. 2005. The importance of dynamic effects on the enzyme activity: X-ray structure and molecular dynamics of onconase mutants. The Journal of Biological Chemistry, 6;280(18):17953-60.
21. Pikkemaat, M. G., B. M. Linssen, J. C. Berendsen, and D. B. Janssen. 2002. Molecular dynamics 355 simulations as a tool for improving protein stability. Protein Engineering, Design and Selection, 15:185–192.
22. Raines, R. T. 1998. Ribonuclease A. Chemical Review, 98:1045-1065.
23. Riccio, G., C. D. Avino, R. T. Raines, C. D. Lorenzo. 2013. A novel fully human antitumor ImmunoRNase resistant to the RNase inhibitor. Protein Engineering, Design & Selection, 26:243–248.
24. Rutkoski, T. J., and R. T. Raines. 2008. Evasion of ribonuclease inhibitor as a determinant of 360 ribonuclease cytotoxicity. Current Pharmaceutical Biotechnology, 9(3):185-9.
25. Sells, , J. Li, and J. Chernoff. 1995. Delivery of proteins into cells using cationic liposomes. BioTechniques, 19(1):72-6.
26. Stigh, E., G. Aqvist, and C. B. Anfinsen. 1958. The Isolation and Characterization of Ribonucleases from Sheep Pancreas. The Journal of Biological Chemistry, 234:1112-1117.
27. Schirrmann, T., J. Krauss, M. A. Arndt, S. M. Rybak, and S. Dubel. 2009. Targeted therapeutic RNases (ImmunoRNases). Expert Opinion on Biological Therapy, 9(1):79-95.
28. Schmid, F., and H. Blaschek. 1984. An early intermediate in the folding of ribonuclease A is protected against cleavage by pepsin. Biochemistry, 23(10):2128‐2133.
29. Sundlass, N. K., and R. T. Raines. 2011. Arginine residues are more effective than lysine residues in eliciting the cellular uptake of onconase. Biochemistry, 50(47):10293-9.
30. Turcotte, R. F., L. D. Lavis, and R. T. Raines. 2009. Onconase cytotoxicity relies on the distribution of its positive charge. The Federation of European Biochemical Societies, 276(14):3846-3857.
31. Tripathy, D. R., A. K. Dinda, A. K., and Dasgupta, S. 2013. A simple assay for the ribonuclease activity of ribonucleases in the presence of ethidium bromide. Analytical Biochemistry, 437(2):126-9.
32. http://www.uniprot.org
33. Welling, G., Scheffer, A., and Beintema, J. 1974. The Primary structure of goat and sheep pancreatic ribonucleases. North-Holland Publishing Company – Amsterdam,41:58- 61.
34. Zeiske, T., Stafford, K. A., and Palmer, A. G. 2016. Thermostability of Enzymes from Molecular Dynamics Simulations. Journal of Chemical Theory and Computation, 14;12(6):2489-92