بهینه‌سازی روش کشت‌ بافت و سیستم انتقال ژن در گیاه کاهو (Lactuca sativa L.)

علوم باغبانی

مقاله 14، دوره 24، شماره 2، اسفند 1389   

نوع مقاله: مقالات پژوهشی

شناسه دیجیتال (DOI): 10.22067/jhorts4.v1389i2.7998

نویسندگان

مهدی محب الدینی^* ؛ مختار جلالی جواران؛ هوشنگ علیزاده؛ فریدون مهبودی؛ حسین خسروی

دانشگاه محقق اردبیلی

چکیده

چکیده
گیاه کاهو (Lactuca sativa L.) از جمله سبزی‌های برگی متعلق به خانواده چتریان (Asteraceae) می‌باشد. دستکاری ساختار ژنتیکی کاهو نیازمند یک روش پایا و موثر کشت بافت و انتقال ژن می‌باشد. با توجه به اینکه گیاه کاهو یک بیوراکتور بسیار مناسب به منظور تولید پروتئین‌های نوترکیب به ویژه واکسن‌های خوراکی است لذا در قالب این پروژه تحقیقاتی سعی شده است علاوه بر بهینه‌سازی سیستم کشت بافت این گیاه، مکانیسم مناسب انتقال ژن به آن تعیین گردد. ابتدا اثرات سن ریزنمونه کاهو ( کوتیلدون‌های 3 و 7 روزه ژنوتیپ محلی اهواز) و 7 ترکیب مختلف از هورمون‌های رشد گیاهی بر روی القا کالوس و شاخه‌زایی مستقیم آزمایش شد. آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی اجرا شد. حساسیت کوتیلدون‌های کاهو به آنتی‌بیوتیک هیگرومایسین با کشت کوتیلدون‌ها روی محیط انتخابی دارای غلظت‌های مختلف هیگرومایسین ارزیابی شد. برای انتقال ژن از آگروباکتریوم سویه LBA4404 حاوی پلاسمید pCAMBIA1304 استفاده شد و روش PCR برای بررسی گیاهان تراریخته مورد استفاده قرار گرفت. بالاترین میزان القا کالوس با استفاده از محیط کشت M1 حاوی 54/0 میکرومولار NAA و 44/0 میکرومولارBA برای نمونه‌های کوتیلدونی 7 روزه بدست آمد. همچنین تعداد بالای شاخه‌زایی مستقیم در محیط‌های کشت M1 (حاوی 54/0 میکرومولار NAA و 44/0 میکرومولار BA) و M7 (حاوی 1/0 میکرومولار NAA و 44/0 میکرومولار BA) حاصل شد. مقدار 15 میلی‌گرم در لیتر هیگرومایسین بطور کامل از باززایی نمونه‌های غیر تراریخت جلوگیری کرد و بنابراین غلظت 15 میلی‌گرم در لیتر از آنتی‌بیوتیک در محیط کشت انتخابگر استفاده شد. شرایط بهینه‌ای برای تراریختگی، از هم‌کشتی ریزنمونه‌های کوتیلدونی با آگروباکتریوم در محیط MS بدون هیچ تنظیم کننده رشدی بدست آمد. آنالیزهای اولیه گیاهان باززایی شده در محیط انتخاب‌گر، در سطح DNA و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن hph صورت پذیرفت و گیاهان تراریخته انتخاب شدند.

واژه‌های کلیدی: کاهو، دستورزی ژنتیکی، کشت بافت، شاخه‌زایی مستقیم، ژن انتخابگر hph