مشکلات پیش روی تشخیص فیتوپلاسماها با استفاده از آزمون Nested PCR

پژوهش های حفاظت گیاهان ایران

مقاله 16، دوره 29، شماره 4 - شماره پیاپی 33، دی 1394، صفحه 624-917   

نوع مقاله: مقالات پژوهشی

شناسه دیجیتال (DOI): 10.22067/jpp.v29i4.45988

نویسندگان

کبری مسلم خانی^{* 1}؛ ساره بقائی راوری²؛ پژمان خدایگان³

¹تربیت مدرس/موسسه تحقیقات ثبت و گواهی بذر و نهال

²دانشگاه فردوسی مشهد

³ولی عصر رفسنجان

چکیده

توانمندی تشخیص و ردیابی صحیح فیتوپلاسماها از گیاهان، اهمیت به سزایی در کنترل موثر این عوامل و جلوگیری از گسترش آنها از طریق مواد گیاهی آلوده دارد. استخراج DNA به گونه ای که کمترین مواد ممانعت کننده و بیشترین میزان ماده ژنتیکی فیتوپلاسما حاصل گردد، در موفقیت آزمون واکنش زنجیره ای پلیمراز و صحت نتایج حاصل از آن تاثیرگذار است. در این تحقیق، مقایسه روش های مختلف استخراج DNA نشان داد که استفاده از روش مناسب، در کاهش واکنش منفی کاذب اهمیت دارد. اما حتی در روش موفق استخراج DNA مبتنی بر استفاده از ستون نیز واکنش های منفی کاذب هرچند به تعداد اندک اما به صورت پراکنده وجود دارد. این امر می تواند ناشی از غلظت پایین و پراکنش نامنظم سلول-های فیتوپلاسمایی در بافت‌های گیاه میزبان باشد. بر اساس نتایج حاصل از تعیین توالی قطعه تکثیر شده با ترکیب آغازگری P1/P7-R16F2n/R16R2، واکنش مثبت دروغین در برخی تکرارهای آزمون Nested PCR به دست آمد. به منظور کاهش آلودگی های متقاطع و اجتناب از واکنش های مثبت دروغین، آزمون Single Tube Nested PCR بهینه سازی گردید. علیرغم دستیابی به محاسن مختلف این روش از جمله سهولت اجرا، صرفه جویی در هزینه و زمان و همچنین توان ردیابی بیمارگر در غلظت های پایین، متاسفانه واکنش های مثبت کاذب در تعداد کمی از نمونه ها همچنان مشاهده شد. در مجموع نتایج حاصل از روش Nested PCR با یک ترکیب آغازگری و به تنهایی برای ردیابی و ارزیابی-های وسیع باغات و مزارع کفایت نمی کند و استفاده از ترکیبات پرایمری مختلف، تعیین توالی و یا هضم آنزیمی به منظور اجتناب از واکنش مثبت دروغین توصیه می گردد.

کلیدواژه‌ها

چالش ها؛ ردیابی و واکنش زنجیره ای پلیمراز

مراجع

1- Ahrens U. and Seemuller E. 1992. Detection of DNA of plant pathogenic mycoplasma like organisms by a polymerase chain reaction that amplifies a sequence of the 16S rRNA gene. Phytopathology, 82: 828-832.

2- Berges R., Rott M. and Seemüller E. 2000. Range of phytoplasma concentrations in various plant hosts as determined by competitive polymerase chain reaction. Phytopathology, 90:1145–1152

3- Borah B.K., Johnson A., Sai Gopal D.V.R. and Dasgupta I. 2008. A comparison of four DNA extraction methods for the detection of Citrus yellow mosaic badna virus from two species of citrus using PCR and dot-blot hybridization. Journal of Virological Methods, 151: 321-324.

4- Cankar K., Stebih D., Dreo T., Ţel J. and Gruden K. 2006. Critical points of DNA quantification by real-time PCR – Effects of DNA extraction method and sample matrix on quantification of genetically modified organisms. BMC Biotechnology, 6: 37-51.

5- Christensen N.M., Nyskjold H. and Nicolaisen, M. 2013. Real-time PCR for universal phytoplasma detection and quantification. Methods in Molecular Biology, 938:245-52.

6- Davis R.E. and Lee M. 1993. Cluster-specific polymerase chain reaction amplification of 16S rDNA sequences for detection and identification of mycoplasma like organisms. Phytopathology, 83: 1008-1001.

7- Davis T.M., Yu H. Haigis K.M. and McGowan P.J. 1995. Template mixing: A method of enhancing detection and interpretation of codominant RAPD markers. Theoretical and Applied Genetics, 91:582-588

8- Deng S.J. and Hiruki C. 1991. Amplification of 16S ribosomal-RNA genes from culturable and nonculturable mollicutes. Journal of Microbiological Methods, 14:53–61

9- Doyle J.J. and Doyle J.L. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical bulletin, 19:11-15.

10- Franova J. 2011. Difficulties with conventional phytoplasma diagnostic using PCR/RFLP analyses. Bulletin of Insectology, 64: 287-288

11- Gundersen D.E. and Lee I.M. 1996. Ultrasensitive detection of phytoplasmas by nested-PCR assays using two universal primer sets. Phytopathologia Mediterranea, 35: 144-151.

12- Harrison N.A., Griffiths H.M., Carpio M.L. and Richardson P.A. 2001. Detection and characterization of an elm yellows (16SrV) group phytoplasma infecting Virginia creeper plants in southern Florida. Plant Disease, 85: 1055–1062

13- Heinrich M., Botti SCaprara L., Arthofer W. and Strommer S. 2001. Improved detection methods for fruit tree phytoplasmas. Plant Molecular Biology Reporter, 19: 169-179.

14- Javaheri M., Ghareyazie B., Delkhosh H.R. and Rahimian H. 2000. Detection of witches’ broom infected citrus trees using polymerase chain reaction. P.147. Proceeding of 14th Iranian Plant Protection Congress. 5-8 Sept. 2000, Esfehan. Iran. (in Persian with English abstract).

15- Jiang J., Aldeisio A.K., Singh A. and Xiao L. 2005. Development of Procedures for Direct Extraction of Cryptosporidium DNA from Water Concentrates and for Relief of PCR Inhibitors. Applied and Environmental Microbiology, 71: 1135–1141.

16- Lee I.M. and Davis R.E. 1986. Prospects for in vitro culture of plant-pathogenic mycoplasma like organisms. Annual Review of Phytopathology. 24:339-354.

17- Lee I-M., Davis R.E. and Gundersen-Rindal D.E. 2000. Phytoplasma: phytopathogenic mollicutes. Annual Review of Microbiology, 54:221–255

18- Lee I-M, Hammond R.W., Davis R.E. and Gundersen D.E. 1993. Universal amplification and analysis of pathogen 16S rDNA for classification and identification of mycoplasmalike organisms. Phytopathology, 83: 834-842.

19- Lepka P., Stitt M., Moll E. and Seemuller E. 1999. Effect of phytoplasmal infection on concentration and traslocation of carbohydrates and amino acids in periwinkle and tobacco. Physiological and Molecular Plant Pathology, 55: 59–68.

20- Leyva-Lopez NE, Ochoa-Sanchez JC, Leal-Klevezas DS, Martinez-Soriano JP. (2002). Multiple phytoplasmas associated with potato diseases in Mexico. Canadian Journal of Microbiology, 48: 1062-1068.

21- Liop P., Bonaterra A., Peñalver J. and Lopez M.M. 2000. Development of a highly sensitive nested-PCR procedure using a single closed tube for detection of Erwinia amylovora in asymptomatic plant material. Applied and Environmental Microbiology, 66: 2071- 2078.

22- Lorenz K.H., Schneider B., Ahrens U. and Seemuller E. 1995. Detection of the apple proliferation and pear decline phytoplasmas by PCR amplification of Ribosomal and non-ribosomal DNA .Phytopathology, 85:771-776

23- McGarvey P. and Kaper J.M. 1991. A simple and rapid method for screening transgenic plants using the PCR. BioTechniques, 11:428–432.

24- Marzachi C. 2004. Molecular diagnosis of phytoplasmas. Phytopathologia Mediterranea, 43: 228-231.

25- Mayr W., Winidhorst S. and Hillemeier K. 2005. Antiproliferative plant and synthetic polyphenolics are specific inhibitors of vertebrate inositol-1,4,5-trisphosphate 3-kinases and inositol polyphosphate multikinase. Journal of Biological Chemistry, 280: 13229–13240.

26- Mirzaee M., Heydarnejad J., Saleh M. Hosseini Pour A., Massumi H. and Shabanian M. 2010. production of polyclonal antiserum against the causal agent of lime witches'-broom. Iranian Journal of Plant Pathology, 45:155- 159. (in Persian with English abstract).

27- Moslemkhani C., Razavi V., Sadeghi L, Mobasser S, Khelgati bana F. and Shahbazi R. 2014. Characterization of phytoplasmas associated with tomato big bud disease, using single-tube nested PCR. Journal Crop Protection, 3:573-580

28- Musetti R., Favali A. and Pressacco L. 2000. Histopathology and polyphenol content in plants infected by phytoplasmas. Cytobios, 102: 133–147.

29- Nolan T., Hands R.E., Ogunkolade W. and Bustin S. 2006. SPUD: A quantitative PCR assay for the detection of inhibitors in nucleic acid preparation. Analytical Biochemistry, 351: 308-310.

30- Pastrik K.H. and Maiss E. 2000. Detection of Ralstonia solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. Journal of Phytopathology, 148: 619-626.

31- Sadeghi A., Salehi M., Faghihi M.M., Bagheri A.N. and Samavi S. 2010. Detection of witches'broom disease of lime phytoplasma in crown region by PCR during latentperiod of the disease. p. 517. Proceeding of 19th Iranian Plant Protection Congress, 31 Jul -3 Aug. 2010, Tehran, Iran. (in Persian with English abstract)

32- Shahryari F., Shams-Bakhsh M., Safarnejad M.R., Safaie N. and Ataei Kachoiee S. 2013. Preparation of Antibody against Immunodominant Membrane Protein (IMP) of Candidatus Phytoplasma aurantifolia. Iranian Journal of Biotechnology 11: 14-21.

33- Siampour M., Izadpanah K., Afsharifar A.R. Salehi M. and Taghizadeh M. 2006. Detection of phytoplasma in insects collected in witches′ broom affected lime groves. Iranian Journal of Plant Pathology, 42: 139-158. (in Persian with English abstract)

34- Wally V., Klausegger A., Koller U., Lochmuller H., Krause S., Wiche G., Mitchell L.G., Hintner H. and Bauer J.W. 2008. 5' trans-splicing repair of the PLEC1 gene. Journal of Investigative Dermatology. 128 (3): pp. 568-574.

35- Wei T., Lu G. and Clover G. 2008. Novel approaches to mitigate primer interaction and eliminate inhibitors in multiplex PCR, demonstrated using an assay for detection of three strawberry viruses. Journal of Virological Methods, 151: 132-139.

36- Zhang Y P, Uymoto J K, and Kirkpatrick B C. (1998) A small-scale procedure for extracting nucleic acids from woody plants infected with various phytoplasmas for PCR assay. Journal of Virological Methods, 71: 45-50.